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血管内皮细胞miRNA对血管生成过程的影响
发布时间:2017-02-27

摘要

 

  血管新生( angiogenesis) 是指在原有血管网基础上,由血管内皮细胞出芽形成新的微血管的过程[1],而血管发生( vasculogenesis) 则是指由中胚层的内皮前体细胞( endothelial precursor cells,EPCs)在原位分化形成新血管的过程[2]. 血管发生被认为主要出现在胚胎形成过程中,而血管新生则在发育及多种生理、病理过程中都存在,包括肿瘤的发生、发展等。 在血管的形成、发育和血管相关疾病发生过程中,作为管脉结构内部屏障的血管内皮细胞起着关键的作用。 事实上,血管新生过程就是内皮细胞经过一系列的变化,包括细胞增殖、迁移、粘附及形成管腔结构等过程而最终形成血管,并组成血管网络。
  
  该过程受到很多血管生成相关因子的调控,包括促血管生成因子和血管生成抑制因子。 在成体组织中,大多数血管保持静止,引导血流; 而一旦血管生成过程失去正常的调控,促血管生成因子活性过高时,可通过激活 MAPK、PI3K 等通路而促进血管内皮细胞的增殖、迁移等[3],最终会导致很多疾病的发生。
  
  血管生成素( angiogenin,ANG) 是一个 14 kD 的碱性核糖核酸酶; 1985 年基于其促血管生成活性而从结肠腺癌细胞 HT29 培养液中被分离纯化[4],且已发现 ANG 在多种肿瘤中表达上调[5]. 虽然 ANG的异常表达与多种肿瘤的发生、发展及恶化相关,具有促血管生成和肿瘤细胞增殖的双重活性,但是目前对 ANG 作用机制的了解仍非常有限。 研究发现,ANG 不仅 可 与 血管 内 皮 细胞 表 面 的 肌 动 蛋白 结合[6],激活细胞外周的蛋白酶,降解基底膜和胞外基质,促进细胞的迁移,而且可激活靶细胞的 Erk1/2、PKB / Akt 和 / 或 SAPK / JNK 信号转导通路而活化细胞[7-9]. 同时,ANG 的促血管生成活性依赖于其核转位能力。 外源 ANG 可快速进入血管内皮细胞的细胞核,特异性地定位于核仁区[10]. 目前认为,ANG通过作用于血管内皮细胞,能诱导细胞迁移[11]、增殖[12]、管腔形成[13]等细胞学事件,而这些事件正是血管生成的基本生物学过程。microRNA( miRNA) 是一类内源性的长约 22 nt的单链小分子 RNA[14],通过与靶基因 mRNA 结合,在转录后水平对基因表达进行广泛调节,从而调控各种生理、病理过程,包括血管生成。
  
  本研究首先利用生物信息学方法预测了靶向ANG-3'UTR 的候选 miRNA,然后验证了它们之间的靶向关系,最后在 ANG 诱导血管生成的主要靶细胞,即血管内皮细胞中检测了这些 miRNA 对血管生成过程的影响。
  
  1 材料与方法
  
  1. 1 材料
  
  人脐静脉血管内皮细胞( HUVEC) 按前所述方法[15]分离自健康新生儿脐带,COS-7 细胞购自上海中科院细胞库。 Human Endothelial-SFM( Invitrogen,GB11111-044 ) 、M199 ( Hyclone,SH30253. 01B ) 、DMEM ( Invitrogen, GB12800-017 ) 、 胎 牛 血 清( Invitrogen,GB10099-141) 、内皮细胞生长补加培养基 ( ECGs, Millipore,02-102 ) 、青 霉 素/链 霉 素( Invitrogen,15140122 ) 、Typsin EDTA ( Invitrogen,GB25200-072 ) 、OPTI-MEM ( Invitrogen,31985 ) 、Lipofectamine2000 ( Invitrogen,GB11668-019 ) 、TrizolReagent( Invitrogen,GB15596-018 ) 、NaAc ( 3 mol / L,pH5. 2) ( Amresco SE521) 、Glycogen( BBI,GB0301) 、MMLV 逆转录酶( Invitrogen,SKU#28025-013) 、dNTPMix( Sangon,D0056 ) 、随 机 引 物 ( Sangon,B0043 ) 、SYBR Premix EX Taq ( TaKaRa RR420A ) 、TaqManUniv PCR MM,no UNG ( ABI,4364343 ) 、TaqmanmicroRNA RT Kit ( ABI,4366597 ) 、β-actin 抗 体( Santa Cruz,sc-1615) 、GAPDH 抗体( Cell Signaling,2118) . siRNA 均购自上海吉玛制药技术有限公司,引物购自上海生工。 ANG 的兔源多克隆抗体为本实验室自备[16].
  
  1. 2 细胞培养与转染
  
  细胞培养: 每 200 mL HUVEC 培养液含 HE-SFM 72 mL、M199 105 mL、FBS 10% 、ECGs 15 μg /mL 和 Penicillin-Streptomycin 1 × . Cos-7 培养液为含10% FBS 的 DMEM. 细胞置于 37℃ 、5% CO2培养箱中培养,生长至 80%融合状态时传代。 细胞转染:接种细胞,生长至 70% ~ 80% 融合状态,换成新鲜的无血清培养液,按照 Lipofectamine 2000 说明书转染 DNA、siRNA 或 miRNA; 转染后4 ~6 h 后,换成含血清的培养液继续培养 24 ~48 h.
  
  1. 3 RNA 提取
  
  用 Trizol 裂解细胞( 1 mL/10 cm2) ,室温静置5 min,收集至离心管中; 加入 0. 2 倍体积的三氯甲烷,振荡混匀,室温静置 5 min; 12 000 g,4℃,离心15 min; 将上层液体转移至新离心管内,加入 1 /10 体积( 上清体积) 的 NaAc( 3 mol/L,pH 5. 2) 和 1 μLGlycogen,然后与 0. 5 倍体积( Trizol 体积) 的异丙醇混匀,-20℃静置1 h;12 000 g,4℃,离心 10 min; 弃上清,加入 1 mL 75% 乙醇,重悬沉淀; 7 500 g,离心 5min; 弃上清,晾干沉淀; 加 30 ~ 50 μL DEPC 水溶解沉淀; 用 NanoDrop 检测 RNA 浓度,分装后 -80℃保存。
  
  1. 4 RT-PCR
  
  反转录: 反应体系总体积为 10 μL,含 DEPC 水1. 5 μL、5 × First Strand Buffer 2 μL、0. 1mol / L DTT 1μL、dNTP ( 10 mmol/L) 0. 5 μL、Random Primer( 100 μmol /L) 0. 5 μL、M-MLV RT ( 200 U/μL)0. 5μL、Total RNA ( 50 ng / μL) 4 μL; 按照程序 25℃10 min、37℃ 2 h、70℃ 15 min 进行反应,反转录产物-20℃保存。
  
  荧光定量 PCR: 反应体系总体积 10 μL,含 ddH2O 2. 3 μL、2 × SYBR 5 μL、50 × ROX Dye 0. 2 μL、Primer Mix ( 1 μmol / L each) 2 μL、cDNA 0. 5 μL; 反应程序为: 95℃,30 s; 95℃,5 s、60℃,30 s ( 40cycles) ; 95℃ ,15 s、55℃ ,15 s、95℃ ,15 s. 引物序列见 Table 1. 加样,封板,离心,在 ABI 7900HT 定量PCR 仪上按照以上程序进行 qPCR.
  
  1. 5 质粒构建
  
  PCR 扩 增 ANG 全 长 cDNA,连 入 载 体pcDNA3. 1,构 建 质 粒 pcDNA3. 1-sigANG-3' UTR 用于真核过表达 ANG; PCR 扩增 ANG 的 3'UTR 基因,连入 psiCHECK-2 载 体,构 建 质 粒 psiCHECK-2-ANG3'UTR 用于双荧光素酶报告基因检测。 所有构建成功的质粒均经过 DNA 测序( 南京金思瑞公司)分析,序列正确的用于进一步的实验。
  
  1. 6 免疫印迹
  
  用 RIPA 裂 解 液 裂 解 细 胞 提 取 蛋 白,并 用Branford 法进行蛋白定量; 取等量蛋白加入等体积 2× Loading Buffer,99℃ 加 热 5 min; 用 15% SDS-PAGE 分离蛋白后,采用湿转法将蛋白质转印至 NC膜上; 用 3%BSA-TBST 封闭 2 h,ANG 一抗按照 1∶ 1000 稀释于封闭液中 4℃ 孵育过夜,TBST 洗膜后用羊抗兔荧光二抗( 1∶ 10 000) 室温孵育 40 min; 避光洗膜后荧光扫描检测。
  
  1. 7 细胞增殖
  
  按一定密度接种细胞于培养皿,孵育过夜; 转染miRNA 或 siRNA,培 养 24 h; 消 化 收 集 细胞,按 照2 000个 / 孔细胞密度接种于 96 孔细胞培养板中,并加入 10 ng/mL bFGF,分别在接种0、24、48、72 h 后,用 CCK-8 试剂盒检测细胞数目,进行统计分析。
  
  1. 8 管腔形成
  
  Matrigel 置冰上,放在 4℃ 过夜融化; 将 Matrigel混匀,均匀铺在 96 孔板底面,每孔 50 μL,避免气泡,所有操作均在冰上进行; 完成后置培养板于37℃ 培养箱,30 ~ 60 min,使 Matrigel 凝固; 消化收集细胞,用无血清培养基 HE-SFM 洗细胞 3 次; 重悬于无血清培养基 HE-SFM 中,细胞计数; 调整细胞密度至 60 000 个/mL,每孔接种 100 μL; 置 37℃培养箱培养,6 h 后观察,拍照; 图片用 Image-Pro Plus 6. 0软件分析,统计管腔长度。
  
  1. 9 统计学分析
  
  实验数据均以平均值 ± 标准差( Mean ± SD)形式表示,每组实验独立重复 3 次。 数据处理采用Graph Prism 5 软件进行。 两组间数据比较采用的 t检验分析( t tests and nonparametric tests) ,多组比较用单因素方差分析,P <0. 05 则具有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2. 1 靶向 ANG 的 miRNA 的预测
  
  根据文献报道,选择较为常用的数据库对靶向 ANG-3'UTR( 3'untranslated region) 的 miRNA 进行预测,包括 TargetScan、miRNA. org 和 MicroCosm( 具体网址见 Table 2) . 通过预测,3 个数据库分别给出 可 能 靶 向 ANG-3' UTR 的 miRNA,结 果 如Table 2 所示。
  
  经综合分析,本论文选择 8 个 miRNAs 进行下一步实验验证,包括 miR-1208、miR-182、miR-196b、miR-198、miR-296-5p、miR-409-3p、miR-570 和 miR-641( 以粗斜体标示在 Table 3 中) . 该 8 个 miRNA 与ANG-3'UTR 的结合位点见 Fig. 1A 所示。
  
  2. 2 候选 miRNAs 的验证
  
  为验证这些预测得到的 8 个 miRNA 是否真正靶向 ANG-3'UTR 而调控 ANG 的表达,本文利用化学合成的 miRNA mimic 分别检测它们对 ANG 的蛋白水平和 mRNA 水平的影响,以及它们与 ANG-3'UTR序列的直接靶向关系。 结果显示,在 HUVEC中分别转染候选的 8 个 miRNA mimic 后,ANG 的蛋白表达水平受到不同程度的抑制( Fig. 1B) ,其中miR-296、miR-409-3p 和 miR-570 对 ANG 的 mRNA水平也有抑制作用( Fig. 1C) ; 在双荧光素酶报告基因检测系统中,miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和miR-641 可以下调连接有 ANG-3' UTR 的报告基因萤光蛋白的表达( Fig. 1D) ,说明 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 可以 直 接靶向结合ANG-3'UTR而抑制 ANG 的表达。 因此,我们进一步对 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 这 4个 miRNA 进行了血管生成相关的功能分析。
  
  2. 3 候选 miRNAs 对血管内皮细胞增殖的影响
  
  分离培养人脐静脉血管内皮细胞,取其中第 3-8 代的细胞用于实验。 按一定密度接种细胞于培养皿中,培养过夜; 转染 miRNA mimic、siRNA 或对照小 RNA 后,继续培养 24 h; 消化收集细胞,按照2000 细胞 / 孔密度接种于 96 孔细胞培养板中,并加入 10 ng/mL bFGF 培养。 分别在接种后的第 0、24、48 和 72 h,用 CCK-8 试剂盒检测细胞数目,进行统计分析。 结果如 Fig. 2 所示,miR-296 和 miR-409-3p能显着抑制 HUVEC 的细胞增殖,效果接近 siANG( siANG 为针对 ANG 的 siRNA) ; miR-641 也可以抑制 HUVEC 的细胞增殖,而 miR-196b 则对 HUVEC的细胞增殖作用几乎没有影响。
  
  2. 4 候选 miRNAs 对血管内皮细胞管腔形成的影响
  
  同时,我们用 HUVEC 的管腔形成实验检测这 4个 miRNA 对血管生成过程的影响。 HUVEC 细胞在转入了不同的 miRNA mimic \siRNA 或对照小 RNA后,以 80 000 细胞/mL 的密度接种于铺有 Matrigel的培养板上,每孔接种 100 μL; 置 37℃培养箱培养,6 h 后观察并拍照,图片用 Image-Pro Plus 6. 0 软件分析,统计管腔长度。 结果如 Fig. 3 所示,miR-196b,miR-296 和 miR-409-3p 能抑制 HUVEC 的管 腔 形成,而 miR-641 则对 HUVEC 管腔形成的抑制作用不明显,其中针对 ANG 的 siRNA 对 HUVEC 的管腔形成抑制作用最明显。
  
  3 讨论
  
  通过本项研究,我们发现 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 可以直接靶向 ANG 而发挥对血管生成的调控作用。 其中,miR-409-3p 通过下调 ANG 调控肿瘤血管生成及肿瘤转移的研究结果已由本实验室报道[16]. 我们的结果显示,这些靶向ANG 的 miRNA 所表现的生物学功能是有差异的,例如 miR-196b 对 HUVEC 的细胞增殖没有影响,但可以抑制 HUVEC 的管腔形成; miR-296 和 miR-409-3p 对 HUVEC 的细胞增殖和管腔形成均有抑制作用; 而 miR-641 则只对 HUVEC 的细胞增殖有抑制作用,提示不同的 miRNA 在调控 ANG 的同时也调控了其它基因,从而影响不同的生物学过程。 因此,只有全面研究 miRNA 对 ANG 的调控,才有可能全面阐明 ANG 的生物学功能及其作用机制。
  
  miRNA 是通过与靶基因 mRNA 的碱基互补配对来引导其对基因的转录后调控的[17],因 此,miRNA 的“seed”序列被认为是指导沉默复合体靶向靶基因 mRNA 的关键序列。 一般地,miRNA 的“seed”序列与靶基因的 mRNA 形成 6 ~8 个碱基的完全互补配对结构。 但是“seed”与靶基因 mRNA 的结合并不一定能介导基因的抑制,该互补结合是miRNA 调控基因的重要条件但并不是充分条件,结合区域以外的序列及因素都可影响 miRNA 对靶基因的识别和调控。 同时,同一个 miRNA 不仅可以抑制靶基因 mRNA 的翻译,也可以引导 mRNA 的降解[18]. 目前认为,mRNA 是否被降解不是由 miRNA本身决定,而是取决于 miRNA-mRNA 形成的双链结构及靶基因 mRNA 的序列,包括其结合位点的数目、位置及间距、结合类型、错配的位置以及与mRNA 结 合 的 不 同 miRNPs ( a novel class ofribonucleoproteins containing numerous microRNAs )等[19-20]. 我们的研究结果显示,有些 miRNA( 如 miR-296、miR-409-3p 和 miR-570 ) 既 可 下 调 ANG 的mRNA 水平,也降低蛋白质表达水平; 而 miR-1208、miR-196b 和 miR-641 只下调蛋白质表达。
  
  需要指出的是,本研究只筛选了靶向 ANG-3'UTR 的 miRNA,没有考虑那些结合在基因编码区或5'UTR 的 miRNA.
  
  参考文献( References)
  
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