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儿科支气管肺泡灌洗液样本肺炎支原体DNA检测研究
发布时间:2018-04-19

  儿童支气管肺炎作为常见的幼儿下呼吸道感染性疾病,主要是由病原体感染所致,无论是发病率还是死亡率都相对比较高,对于幼儿的生命安全和身体健康有着很大的威胁。调查数据显示,每年全球大概有100 万~200万的儿童是因为小儿肺炎致死[1-2],其中肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)占儿童类肺炎中的比例在20%~40%,并且这一比例随着儿童年龄的增加而有上升的趋势[3-4].从肺炎的诊治情况来看,目前临床诊断MPP感染通常仍然采用血清学方法,而这种诊断方法受到抗体出现的时相等多方面因素影响的概率比较大[5-6],进而对支气管肺炎的诊治造成了一定的干扰。支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)是以纤维支气管镜嵌入到肺段或亚段支气管水平反复以无菌生理盐水灌洗回收的液体,对肺泡灌洗液对行肺炎支原体检测并分析分布作为研究肺部疾病病因发病机制是诊断评价疗效和判断预后的一项手段,其检测结果对促进患儿的治疗、用药、康复、减少并发症有极大的帮助。利用PCR方法直接检测肺炎支原体DNA,是现阶段最有效的检测方法,具有低成本、快速、准确的特点,该文即是对2015年1月-2017年6月间东莞市妇幼保健院168例送检的BALF进行肺炎支原体DNA检测,现对检测结果总结分析如下。
  
  1、资料与方法
  
  1.1 一般资料
  
  回顾分析该院所有送检168例,BALF样本利用荧光PCR方法检测肺炎支原体DNA,BALF样本按患儿性别设男95例、女73例两组,按不同年龄阶段把受检患儿分为<1岁72例、1~3岁43例、4~6岁30例、≥7岁23例共4个年龄组。
  
  1.2 样本采集
  
  所有患儿均符合文献[7]《诸福棠实用儿科学》支气管镜检查的适应证,予电子支气管镜检查。采用Olympus公司生产的EVIS LUCERA CV-260 系列型电子支气管镜。纤维支气管镜检查,术前6 h禁食,予以静脉镇静加局部麻醉的方法,采用2%利多卡因咽喉部局麻,纤维支气管镜经鼻、咽喉、声门进入气道,观察支气管形态,37℃生理盐水灌洗至炎症严重的肺段,1.0 mL/kg 至少灌洗3次,随即负压吸引以获取BALF,标本置一次性无菌硅化收集器中。
  
  1.3 检测方法
  
  BALF检测:主要利荧光PCR方法,以MP保守基因片段设计特异引物及特异Taqman探针,采用ABI 7500 FAST荧光PCR仪,项目试剂来自广州达安基因科技有限公司,将BALF标本充分振荡摇匀,吸取液体转至1.5 mL离心管中,1 200 r/min离心5 min,弃上清液,取沉淀加入50 μL核酸提取液,混匀后2 000 r/min离心10 s,100℃干浴10 min,12 000 r/min离心10 min,2 μL上清液加入43 μL反应液中进行PCR扩增。设备操作严格按照说明书操作。
  
  1.4 统计方法
  
  所有数据用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析,计数资料用[n(%)]表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  
  2、结果
  
  2.1 不同性别较
  
  168例肺泡灌洗液检测肺炎支原体结果显示43例阳性,总的阳性率为25.6%.男性患样样本95例,阳性26例,阳性率为27.3% (26/95),女性患样样本73例,阳性17例,阳性率为23.2%(17/73),统计显示不同性别MP阳性率差异无统计学意义(χ2=0.361,P=0.548)。见表1.
  
  2.2 不同年龄段比较
  
  统计显示不同年龄段MP阳性率差异有统计学意义(χ2=24.5,P<0.05),其中4~6岁年龄段阳性率最高,达到53.3%(16/30),小于1岁年龄段阳性率最低。见表2.
  
  2.3 不同性别、年龄段比较
  
  统计显示,相同年龄段,不同性别MP阳性率差异无统计学意义,同时显示相同性别各年龄段阳性率差异有统计学意义,男性组和女性组都显示小于1岁的阳性率明显低于4~6岁年龄段。见表3.
  
  3、讨论
  
  小儿肺炎是儿科常见病,是婴幼儿死亡的常见原因,在众多引起小儿肺炎的因素中,病原体感染占很大的比例,而在病原体感染的肺炎中,MPP肺炎所占的比例在10%~20%,且呈现出逐年增加的趋势,在流行年份更是高达30%.在发病的时间方面,MPP肺炎全年均可发生[8-9].相关研究表明,MPP的发病率近年来呈现出逐渐增高的趋势,并且重症患者的比例也在逐年增长,而MPP治愈后通常会带有诸如闭塞性支气管炎、闭塞性细支气管炎、支气管扩张及透明肺等后遗症,对于儿童的身体健康成长和发育产生重大的威胁[10].对于肺炎支原体的检测临床主要有检测血清IgM抗体,虽然该方法操作起来相对比较简单,所需要的时间也相对比较短,但是这种方法的敏感性不高,IgM抗体一般在感染后7~10 d才会出现,体内存在时间长,感染控制后,抗体仍可存在2个月余,且免疫功能低下者可能出现抗体产生不足,容易导致结果检测失败;另外抗体滴度的高低与临床症状轻重的相关性不高,而且抗体检测容易出交叉反应而出现假阴性。还有一种是咽拭了标本检测肺炎支原体DNA,但其标本采集有局限性,不能准确表达下呼吸道病原体,而且对取材操作要求很高。鼻咽拭子虽可反映上、下呼吸道感染,但对上呼吸道感染更敏感,而BALF是直接从下呼吸道感染部位获取的标本,对儿童肺炎病原学诊断具有重要意义[11],BALF是应用纤维支气管镜进行支气管肺泡灌洗,利用支气管肺泡灌洗液进行病原体直接检测,对一些下呼吸道疾病和诊断、病情观察和预后判断开辟了一条新途径。BALF在肺部感染的病原学诊断中价值较高,该文即是利用BALF对引起小儿支气管肺炎的常见肺炎支原体进行DNA检测,分析168例BALF检测MP-DNA结果显示43例阳性,总的阳性率为25.6%,低于陈微等研究报道的阳性率(80.0%)[12],可能与所有BALF患儿是普通肺炎患儿,未进行筛选,统计显示感染率无性别差异,对各年龄阶段的阳性率的研究,未见报道,该文是第一次涉及,4~6岁年龄段阳性率最高,达到53.3%(16/30),符合阳性率随年龄而增加的报道,小于1岁年龄段阳性率最低。
  
  综上所述,BALF细胞学计数和MP耐药基因检测对儿童RMPP早期识别有一定的参考价值。对于BALF检测项目方面,本文只涉及到MP-DNA检测,其实可以拓展到很多项目的检测,如肺炎衣原体、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等,为临床这些病原体感染的肺炎开辟了一个新的标本类型检测方案,弥补现有血清、咽拭了标本检测方面的不足。而且,由于该研究纳入病例数量较少,且观察时间短,故存在一定的局限性。相关结论还需要多中心大样本的临床资料进一步探究。

 

  [参考文献]
 
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